Transcriptase inverse nouvelle génération pour le RNA-Seq
Enzyme TGIRT-III et kit TGIRT template-switching RNA-seq
L'enzyme TGIRT® III est une transcriptase inverse de nouvelle génération qui présente de nombreux avantages :
- Il est possible de faire simultanément la transcription inverse et l'addition des adaptateurs RNA-Seq aux ARN de toutes tailles et structures.
- Moins de biais qu'avec d'autres méthodes
- Il est possible d'obtenir des lectures complètes d'ARNt et d'autres ARN structurés non codants
Il existe 2 variations à la méthode en fonction de la taille des ARN
- Une pour le séquençage des petits ARN : Les ADNc purifiés par PAGE et sélectionnés par leur taille sont circularisés avec l'enzyme CircLigaseII
- Une autre pour le séquençage des ARN totaux de toutes tailles
Disponible en 2 formats : Enzyme seule et kit
Description
Conditionnement
Réfétence
50 µl
TGIRT50
5x50 µl
TGIRT5x50
10x50 µl
TGIRT10x50
25 rxns
KTGIRT-25
Avantages de l'enzyme :
1. Profilage complet du transcriptome par brin.
Le TGIRT®-seq d'échantillons d'ARN de référence humaine universels fragmentés et ribodéplétés résume l'abondance relative des transcrits humains et des pics d'activité comparable à celle de TruSeq v2 non spécifique à un brin et supérieure à celle de Tru-Seq v3 spécifique à un brin. TGIRT®-seq est nettement plus spécifique à un brin que TruSeq v3 et élimine les biais d'échantillonnage de l'amorçage hexamère aléatoire inhérents à TruSeq. TGIRT®-seq présente une couverture génique de 5 'à 3' plus uniforme et identifie plus de jonctions d'épissage que TruSeq. TGIRT®-seq permet de profiler simultanément les ARNm et les ARNnc (ARN non codants) dans le même ARN-seq que les petits ARNc structurés, y compris les ARNt, qui sont essentiellement absents des jeux de données TruSeq.
2. ARN-seq d'ARN de cellules entières, exosomal, de plasma et d'autres ARN extracellulaires
Temps de traitement rapide (<5 h pour la construction de la bibliothèque d'ARN-seq via l'étape PCR); nécessite de petites quantités d'ARN (plage de ng faible); profils de transcription complets comprenant des ARNm et des ARNInc associés à de petits ARNnc, y compris des lectures complètes d'ARNt, de pré-miARN et d'autres petits ARNnc structurés; moins de biais et une plus grande spécificité de brin que les méthodes conventionnelles.
3. Construction d'une bibliothèque d'ARN-seq via TGIRT®, telles que RIP-seq, HITS-CLIP, irCLIP, CRAC, profilage du ribosome.
Temps de traitement rapide (<5 h pour la construction de la bibliothèque d'ARN-seq via l'étape PCR); nécessite de petites quantités d'ARN (plage de ng faible); ne nécessite pas d'ARN ligase, est moins biaisée et plus efficace en ayant moins d'étapes dans la procédure.
4. Une thermostabilité, une processivité et une activité de déplacement de brin supérieures aux RT rétrovirales.
Permet la construction de banques d'ARN polyadénylées d'ARN-seq en utilisant une amorce oligo (dT) ancrée avec une couverture plus uniforme de 5 'à 3' que les RT rétrovirales sans étape de ribodéplétion.
Permet la cartographie de structure d'ARN via des méthodes basées sur l'électrophorèse capillaire telles que SHAPE ou la cartographie de structure DMS avec des longueurs de lecture significativement plus longues et moins d'arrêts prématurés que pour les RT rétrovirales.
Permet l'analyse de modèles d'ARN contenant des extensions de répétition riches en GC.
Permet la synthèse d'ADNc de bout en bout complets d'ARNt et d'autres petits ARNnc structurés / modifiés, qui sont réfractaires aux RT rétrovirales.
5. Séquençage d'ADN génomique simple brin de plasma humain et de E. coli.
Captures de bouts d'ADN précis avec un flux de travail plus simple en lançant la synthèse d'ADN directement à l'extrémité 3 'd'un brin d'ADN tout en fixant simultanément un adaptateur ADN-seq sans réparation, ni queue ni ligature. Permet l'analyse du positionnement des nucléosomes, des sites de liaison aux facteurs de transcription, des sites de méthylation de l'ADN et des tissus d'origine.
Propriétés des enzymes et activité nouvelle:
- Une thermostabilité, une processivité et une fidélité plus élevées que les transcriptases inverses rétrovirales, permettant une synthèse complète d'ADNc de bout en bout à partir d'ARN hautement structurés ou fortement modifiés (par exemple, d'ARNt) et d'ARN contenant des expansions répétées riches en GC.
- Nouvelle activité de commutation de matrice de bout en bout qui permet la fixation d'adaptateurs d'ARN ou de PCR lors de la transcription inverse et élimine la nécessité d'une étape de ligature d'adaptateur 3'-ARN distincte.1 Cette activité de commutation de matrice facilite grandement l'ARN spécifique au brin. -seq construction de la bibliothèque avec moins de biais que les procédures utilisant un amorce hexamère aléatoire ou utilisant de l'ARN ligase pour la ligature de l'adaptateur.
- Synthèse efficace d'ADNc à partir d'amorces recuites. L'amorce recuite devrait avoir une Tm prévue supérieure à 60 ° C. La pré-incubation de l'enzyme avec le substrat dans le mélange réactionnel pendant 30 min à température ambiante et l'initiation de la réaction par addition de dNTP sont recommandées. Les conditions optimales pour les nouvelles applications doivent être déterminées en testant une plage de concentrations de sel allant de 25 à 450 mM de NaCl.
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